Khamenei uppgav att "Israel inte kommer överleva länge" och kallade både Hamas attack den 7 oktober och Irans egen robotattack mot Israel tidigare i veckan för "berättigade".
Efter Khameneis tal hölls en minnesstund för Hizbollah-ledaren Nasrallah, som dödades i ett israeliskt flygangrepp i slutet av september i Beirut.
Tisdagens robotattack från Iran mot Israel beskrevs som en hämnd för Nasrallahs död, och Irans högsta militära ledning varnade Israel för ytterligare attacker – särskilt mot landets energiinfrastruktur – om Israel skulle "begå ett misstag".
– Vårt motstånd kommer inte upphöra och vi kommer att vinna. Israel kommer aldrig besegra Hamas och Hizbollah, sade ayatollan under sitt tal.