Initiativet till folkomröstningen kom från den katolska gruppen I familjens namn. Organisationen hade samlat 740 000 namnunderskrifter till stöd för en folkomröstning. Kroatiens parlament var därför enligt lag tvunget att anordna en folkomröstning i frågan.
Jag är glad, eftersom från och med nu kommer ingen framtida regering att kunna legalisera homoäktenskap, säger I familjens namns ledare Zeljka Markic, enligt Reuters.
Den katolska kyrkan stödde förslaget. 90 procent av Kroatiens omkring 4,4 miljoner invånare betraktar sig som katoliker.
66 procent av de röstande sade ja till förslaget. Valdeltagandet var 37 procent.
Många östeuropeiska länder, bland annat Polen, Bulgarien, Serbien och Vitryssland, har tidigare infört liknande bestämmelser i sina grundlagar.